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一文看懂魚(yú)ELISA試劑盒的實(shí)驗條件和要求

更新時(shí)間:2020-08-25      瀏覽次數:1467
  魚(yú)ELISA試劑盒的實(shí)驗要求:
  一、做好對照
  正式試驗時(shí),應分別以陽(yáng)性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應作一式二份,以保證實(shí)驗結果的準確性。有時(shí)本底較高,說(shuō)明有非特異性反應,可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
  二、實(shí)驗條件的選擇
  在ELISA中,進(jìn)行各項實(shí)驗條件的選擇是很重要的,其中包括:
  (1) 固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被,在同一實(shí)驗條件下進(jìn)行反應,觀(guān)察其顯色反應是否均一性,據此判明其吸附性能是否良好。
  (2) 包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí),要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18~24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的較適濃度需進(jìn)行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后,在其它試驗條件相同時(shí),觀(guān)察陽(yáng)性標本的OD值。選擇OD值較大而蛋白量較少的濃度。對于多數蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1~10μg/ml。
  (3) 酶標記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見(jiàn)酶標記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗系統里準確地滴定其工作濃度。
  (4) 酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應,而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是較為滿(mǎn)意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后,應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時(shí)間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前加入。
  進(jìn)口分裝:
  檢測范圍和靈敏度不同,用量少時(shí),可使用分裝,前期是它的長(cháng)久性不是很好。
  試劑盒的標準曲線(xiàn)較高點(diǎn)OD 值均在2.0±0.2,零孔的OD 值都控制在0.10以下。
  試劑盒的標準曲線(xiàn)相關(guān)系數R≥0.98。
  試劑盒重復性好,板內、板間變異系數均<9 %。
  試劑的組份都多給20%的富余量,確保完成48/96孔的檢測,避免分次檢測可能造成試劑量不足的情況。
  檢測抗體及酶結合物的稀釋度合適(均為1:30), 方便試驗操作者準確地做稀釋工作,保證實(shí)驗結果的重復性。
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