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酶聯(lián)免疫檢測試劑盒抗體的酶標記方法及標記效果測定

更新時(shí)間:2021-12-18      瀏覽次數:757
  今天小編給大家講講酶聯(lián)免疫檢測試劑盒抗體的酶標記方法及標記效果測定:
 
  1.標記方法 良好的酶結合物取決于兩個(gè)條件:即高效價(jià)的抗體和高活性的酶。抗體的活性和純度對制備標記抗體至關(guān)重要,因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過(guò)程中,抗體的活性有所降低,故需要純度高、效價(jià)高及抗原親和力強的抗體球蛋白,最好使用親和層析提純的抗體,可提高敏感性,而且可稀釋使用,減少非特異性吸附。
 
  酶與抗體交聯(lián),常用戊二醛法和過(guò)碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標記抗體的改良過(guò)碘酸鈉法簡(jiǎn)單易行,標記效果好,特別適用于實(shí)驗室的小批量制備。其標記程序為:將5μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中,加入新鮮配制的0.06 mol/L的過(guò)碘酸鈉(NaIO4)水溶液0.5ml,混勻置4℃冰箱30分鐘 , 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室溫放置30分鐘后加入含5(g純化抗體的水溶液1ml,混勻并裝透析袋,以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(shí)(或過(guò)夜)使之結合,然后吸出,加硼氫化鈉(NaBH4)溶液( 5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小時(shí),將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液,置4℃冰箱30分鐘后離心,將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中,并對之透析過(guò)夜(4℃),次日離心除去不溶物,即得到酶標抗體,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,進(jìn)行測定后,冷凍干燥或低溫保存。
 
  2.酶標抗體標記效果測定:測定內容包括酶和抗體活性、結合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結合率。
 
  (1) 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴散或免疫電泳法,使抗原與抗體形成沉淀線(xiàn),經(jīng)PBS漂洗1天,再以蒸餾水浸泡1小時(shí),將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著(zhù)色,如果出現應有的顏色反應,再用生理鹽水浸泡,顏色仍然不褪,表示結合物既有酶的活性,也有抗體活性。良好的結合物在顯色后,瓊擴滴度應在1:16以上。另一個(gè)測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫檢測試劑盒)方法進(jìn)行方陣滴定,此法不僅可以測定標記效果,還可以確定酶標抗體的使用濃度。
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